Un virus de la rabia modificado ilumina los circuitos neuronales

Los científicos han convertido un virus mortal en una herramienta crucial para comprender el cableado del cerebro.

Publicado originalmente por Hannah Thomasy, PhD, para The Scientist, el 14 de junio de 2024

Virus de la rabia etiquetados ayudan a los científicos a identificar neuronas en la corteza visual primaria que conectan con dos regiones visuales superiores diferentes del cerebro. Crédito: Marina Garrett.

En 1906, el patólogo Camillo Golgi y el neurocientífico Santiago Ramón y Cajal ganaron el Premio Nobel por sus trabajos sobre la estructura del sistema nervioso. Más de un siglo después, el rompecabezas de la organización del sistema nervioso - la intrincada maraña que resulta de las interconexiones de miles de neuronas - sigue incompleto.

Sin embargo, desarrollar plenamente la comprensión científica de estas conexiones es crucial, afirma Edward Callaway, neurobiólogo de sistemas del Instituto Salk. "Si no se sabe cómo interactúan las distintas partes, no hay forma de generar una hipótesis sobre cómo funcionan juntas".

Desentrañar esta compleja red para crear un mapa ordenado de las conexiones neuronales es un problema en el que los investigadores llevan trabajando décadas. En los años ochenta, los investigadores empezaron a buscar un marcador que pudiera funcionar como trazador transneuronal. Necesitaban algo que pudiera saltar a través de las sinapsis, propagándose de neurona en neurona con la suficiente eficacia como para alcanzar niveles detectables incluso en células conectadas a grandes distancias. Por suerte para los científicos (aunque quizá por desgracia para la humanidad en general), un puñado de virus especializados en neuronas han evolucionado para hacer exactamente eso.

Gracias al trabajo de virólogos pioneros, la neurocientífica Gabriella Ugolini, ahora en el Instituto de Neurociencias de París-Saclay, sabía que el virus del herpes simple ₁ (VHS-1) infectaba preferentemente a las neuronas y que podía propagarse a través de las conexiones sinápticas. A diferencia de un colorante o una toxina, un virus no necesitaría atravesar las sinapsis en grandes cantidades porque podría replicarse hasta niveles detectables utilizando la maquinaria celular del huésped. A finales de la década de 1980, demostró que, cuando se inyectaba en un nervio periférico, el VHS-1 se propagaba a través de las sinapsis hasta las neuronas del cerebro.₁ Las neuronas infectadas por el virus podían identificarse fácilmente en secciones de tejido cerebral mediante inmunohistoquímica, lo que proporcionaba una imagen clara de las cadenas de conexión.

A principios de la década de 2000, varios investigadores utilizaron el herpes y la rabia,  virus neurotrópicos, para trazar conexiones dentro del cerebro. Peter Strick, actualmente neurocientífico de la Universidad de Pittsburgh, había cartografiado el circuito motor entre los ganglios basales y el córtex, y Jeffrey Friedman, genetista molecular de la Universidad Rockefeller, había cartografiado las entradas al hipotálamo utilizando el primer sistema de rastreo vírico específico para un tipo de célula._2,3

Estos sistemas víricos funcionaban casi demasiado bien. Una vez que un virus empezaba a replicarse, se propagaba de célula en célula sin parar. "No había forma de determinar inequívocamente cuántas sinapsis se habían cruzado", explica Ian Wickersham, que ahora investiga la neuroingeniería genética en el Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT). "El virus se propaga a través de diferentes sinapsis a ritmos diferentes, dependiendo de la cantidad de hardware que haya para apoyar la propagación a través de cada sinapsis en particular".

Así pues, Callaway y Wickersham (en aquel momento estudiante de posgrado en el laboratorio de Callaway) se propusieron desarrollar un virus trazador que sólo pudiera establecer una infección inicial en un subconjunto definido de neuronas. A continuación, tras proliferar en estas células "iniciadoras", el virus sólo atravesaría una sinapsis, etiquetando así únicamente la célula iniciadora y las células directamente conectadas a ella.

Véase también: https://www.the-scientist.com/a-cell-by-cell-map-of-the-entire-mouse-brain-72679

Viralidad

Como Friedman ya había desarrollado un tipo de herpesvirus, el Ba2001, que sólo podía infectar tipos celulares específicos, Wickersham intentó primero modificar este virus para que sólo pudiera atravesar una sinapsis.₄ Sin embargo, los investigadores se encontraron repetidamente con problemas de toxicidad: El virus mataba las neuronas con demasiada rapidez.

"Por lo general, sólo veíamos tejido con un aspecto cutre y muerto", recuerda Callaway.

Volvieron a la pizarra de dibujo y empezaron de nuevo con el virus de la rabia, un asesino mucho más lento, que de forma natural cruza las sinapsis únicamente en dirección retrógrada. Sin embargo, el virus de la rabia presentaba sus propios retos. Para transformar el virus de tipo salvaje en un trazador monosináptico específico de un tipo celular, necesitaban modificar su genoma. No era tarea fácil, ya que las estrategias actuales de modificación del genoma se dirigían sobre todo al ADN, y la rabia es un virus de ARN de cadena negativa. Buscando en la literatura científica, Wickersham descubrió que alguien ya había resuelto este problema. Karl-Klaus Conzelmann, virólogo de la Universidad de Múnich, había descubierto cómo eliminar el gen de la glucoproteína de espiga de la rabia, que permite al virus propagarse de una neurona a otra._4,5

Este virus modificado era el punto de partida perfecto para su proyecto y, afortunadamente, Conzelmann estaba dispuesto a compartir su creación con el equipo del Instituto Salk. Al transfectar las neuronas iniciadoras con un plásmido que contenía el gen de la glicoproteína que faltaba, los investigadores garantizaron la presencia de la glicoproteína en estas células. El virus podía entonces utilizar esta glicoproteína disponible para hacer copias infecciosas de sí mismo, construyendo la envoltura recubierta de glicoproteína que necesitaba para entrar en las neuronas conectadas sinápticamente.

A la izquierda, neuronas moradas en el mesencéfalo de ratón; a la derecha, una vista más cercana de las neuronas en rojo, que muestra la supervivencia a largo plazo de las neuronas infectadas.Los científicos utilizan el trazado monosináptico de segunda generación para etiquetar las neuronas que expresan dopamina (azul) en la sustancia negra del ratón (izquierda) y las neuronas del cuerpo estriado (derecha) que proporcionan entrada a estas células. Las células iniciadoras se muestran en verde; las células que contienen el virus se muestran en rojo. Crédito: Ian Wickersham y Lei Jin

Al entrar en las neuronas presinápticas, el virus se desprotege y pierde su envoltura de glicoproteína para liberar el genoma que se transcribirá. El virus puede replicarse en estas neuronas secundarias, un rasgo útil para los científicos que esperan rastrear una señal fluorescente. Sin embargo, como estas células no han sido modificadas para producir glicoproteína y el virus modificado no contiene el gen de la glicoproteína, no puede crear copias infecciosas de sí mismo y, por tanto, no puede propagarse más lejos.

Sin embargo, esto era sólo la mitad de la batalla. Todavía tenían que averiguar cómo garantizar que la infección inicial se produjera únicamente en una población definida de células iniciadoras. Por casualidad, Callaway mencionó su enigma a otro científico del Instituto Salk, el microbiólogo John Young.

Como investigador postdoctoral a principios de la década de 1990, Young había estudiado un virus denominado virus del subgrupo A del sarcoma y la leucosis aviar (ASLV-A), centrándose especialmente en cómo la entrada viral estaba mediada por interacciones entre la proteína de la envoltura viral (EnvA) y una proteína de la superficie celular aviar denominada receptor A del virus tumoral (TVA). Este sistema de cerradura y llave altamente específico, que no existía de forma natural en los tejidos de mamíferos, era exactamente lo que los investigadores necesitaban para dirigirse a una población definida de células iniciadoras.

Una única neurona "iniciadora" (en amarillo) se conecta a multitud de neuronas (en verde). Crédito: Euiseok Kim

"No puedo creer la suerte que tuve de que John hubiera encontrado literalmente la solución perfecta a este problema en su laboratorio anterior", afirma Wickersham. Por fin, tras años de experimentos, el equipo estaba listo para encajar todas las piezas del rompecabezas. Trabajando con cortes de tejido cerebral, transfectaron neuronas iniciadoras con plásmidos que codificaban la glicoproteína de la rabia y el receptor de la TVA. Luego introdujeron el trazador, un virus de la rabia verde fluorescente que carecía de su glicoproteína nativa y estaba perfectamente empaquetado en una envoltura viral tachonada con EnvA del virus aviar.

Tal como esperaban los investigadores, la clave EnvA del trazador encajaba perfectamente en los receptores TVA de las células iniciadoras, pero era incapaz de iniciar una infección en ninguna célula sin esta proteína aviar. Aprovechando la glicoproteína de las células iniciadoras, el virus pudo hacer copias infecciosas de sí mismo, que se propagaron a cada neurona presináptica conectada a la célula iniciadora. Una vez en estas células conectadas, el virus se encontró sin glicoproteína y no pudo propagarse más, etiquetando finalmente cada célula iniciadora y sus conexiones directas con un hermoso verde fluorescente brillante.₆

Armas, gérmenes y... cerebros

Para su primera publicación de prueba de concepto, los investigadores utilizaron una técnica llamada transfección biolística para el paso inicial de transfección. "Utilizamos una pistola de genes, que es básicamente como una pistola de aire comprimido que dispara unas bolitas de oro recubiertas de ADN a las células", explica Wickersham.

Sin embargo, nunca se pensó que ésta fuera la versión final de la técnica. El cañón genético no podía utilizarse in vivo y limitar el trabajo a cortes cerebrales que suelen tener menos de un milímetro de grosor dificultaría enormemente la identificación de neuronas conectadas a distancia.

Para superar este problema, los investigadores recurrieron al mundo en rápida expansión de las líneas de ratones transgénicos Cre. En lugar de utilizar la pistola génica para administrar los genes del receptor TVA y de la glicoproteína de la rabia a las neuronas iniciadoras, desarrollaron un virus ayudante del virus adenoasociado (AAV) dependiente de Cre que, al inyectarse en el cerebro, dio lugar a la expresión de estos dos genes sólo en neuronas que también expresaban la recombinasa Cre. Posteriormente, se inyectó el virus de la rabia modificado, lo que dio lugar al mismo rastreo anterógrado monosináptico, esta vez en un animal vivo.₇

Aunque esta versión de la técnica de rastreo transsináptico basada en la rabia se sigue utilizando ampliamente en la actualidad, Callaway, Wickersham y otros han ampliado enormemente las capacidades originales de esta herramienta. El grupo de investigación de Callaway demostró que esta técnica podía utilizarse no sólo para etiquetar neuronas conectadas, sino también para suministrar herramientas que informaran, suprimieran o mejoraran la actividad neuronal y manipularan la expresión génica.₈ El grupo de Wickersham en el MIT desarrolló un sistema de segunda generación con toxicidad reducida, que permitía el etiquetado a largo plazo de neuronas conectadas sin matar las células ni afectar sustancialmente a su función.₉ Ahora, sus grupos de investigación, así como otros, esperan llevar la técnica aún más lejos.

Véase también: https://www.the-scientist.com/a-novel-panic-pathway-in-the-brain-71837

Ampliación para estudiar las conectopatías

Aunque la técnica Cre-dependiente original sigue siendo útil para los científicos que estudian tipos celulares amplios, como las neuronas glutamatérgicas o dopaminérgicas, es insuficiente para captar plenamente la increíble complejidad del cerebro. Se cree que incluso el cerebro de un ratón, relativamente sencillo en comparación con el humano, contiene más de 5.000 tipos celulares diferentes.

El virus de la rabia modificado revela conexiones entre las células "iniciadoras" de la corteza sensorial primaria del ratón (rosa) y las neuronas de muchas otras regiones del cerebro (negro). Crédito: Austin Schubert

Para captar esta notable diversidad y crear mapas más completos de la conectividad neuronal, los investigadores están combinando el rastreo transsináptico basado en el virus de la rabia con la secuenciación de ARN unicelular.

Como investigador postdoctoral en el grupo de investigación de la Facultad de Medicina de Harvard del neurobiólogo Steven McCarroll, Arpiar Saunders se familiarizó con la secuenciación de ARN unicelular, creando mapas de expresión de ARN que contenían cientos de miles de células cerebrales.₁₀ Saunders, ahora neurofisiólogo en la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón, dijo: "La siguiente pregunta era: después de conocer los componentes básicos del cerebro, ¿cómo [averiguamos] cómo se ensamblan esos componentes básicos en circuitos neuronales?".

Para responder a esta pregunta, Saunders y McCarroll desarrollaron el método de análisis del código de barras sináptico por lectura retrógrada de la rabia, también conocido como SBARRO, que analiza el ARN viral y el de la célula huésped.₁₁ Con SBARRO, dijo Saunders, "se puede reconstruir la red de la que formaba parte la célula individual y también el tipo molecular de esa célula". Para captar muchas redes individuales en un solo experimento, generaron una biblioteca de virus de la rabia, cada uno de los cuales contenía un código de barras de 20 pares de bases. Esto permitió a los investigadores identificar las células conectadas haciendo coincidir sus códigos de barras virales.

En la primera demostración de esta técnica, los investigadores utilizaron redes de células cerebrales cultivadas, pero Saunders trabaja actualmente en la aplicación de esta técnica de código de barras vírico a tejidos cerebrales intactos de ratones y, con el tiempo, de primates no humanos. Con un planteamiento algo distinto, Wickersham también está desarrollando una técnica de cartografía sináptica de tejidos cerebrales intactos utilizando virus de la rabia con código de barras y secuenciación in situ, en colaboración con la neurocientífica Xiaoyin Chen, del Allen Institute for Brain Research.₁₂

Según declaraciones de Arpiar Saunders, Oregon Health and Science University "en biología ha habido una serie de técnicas que han tenido una gran repercusión al dividir un problema muy complejo en unidades fundamentales fáciles de medir", explica Saunders. En este caso, cada unidad consiste en una célula y todas sus conexiones presinápticas. Aunque aún quedan retos metodológicos por resolver, Saunders espera que estas técnicas permitan a los científicos identificar estas unidades, que con el tiempo podrán ensamblarse computacionalmente en un diagrama completo del cableado cerebral.

En los próximos dos años, el objetivo de nuestro grupo y probablemente de otros es obtener imágenes de miles de redes monosinápticas en un cerebro de ratón intacto para hacernos una idea cuantitativa de la organización sináptica de los circuitos neuronales. Parece una locura, pero esa es nuestra aspiración", afirma Saunders. "Pero soy optimista y creo que podremos conseguirlo".

Sin embargo, la creación de los diagramas de cableado es sólo el primer paso. "Nos interesa mucho entender cómo los trastornos del neurodesarrollo pueden se un reflejo de trastornos del cableado neuronal, o conectopatías", explica Saunders.₁₃ "Hay pruebas genéticas sorprendentes de que las mutaciones asociadas al autismo y la esquizofrenia están enriquecidas con genes que codifican proteínas sinápticas. También sabemos, por un trabajo muy centrado en hipótesis sobre sinapsis concretas, que se producen cambios [en estos trastornos]. Pero aún no tenemos forma de elaborar descripciones generales del tipo de cambios en la conectividad que podrían estar produciéndose, y ése es nuestro objetivo".

References

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    Kelly RM, Strick PL. Macro-architecture of basal ganglia loops with the cerebral cortex: use of rabies virus to reveal multisynaptic circuits. Prog Brain Res. 2004;143:449-459.

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