Un equipo de investigadores define un protocolo para la obtención imágenes de alta resolución de células vivas, utilizando un Microscopio de Fuerza Atómica (MFA)
Publicado originalmente por Kanazawa University, el 5 de septiembre de 202
Las imágenes de estructuras a nanoescala del interior de las células vivas tienen una demanda cada vez mayor por los conocimientos que sobre la estructura y función celular pueden revelar. Hasta ahora, las herramientas para capturar tales imágenes han sido limitadas, pero un equipo de investigadores de la Universidad de Kanazawa, dirigidos por Takeshi Fukuma y Takehiko Ichikawa, han ideado e informado de un protocolo completo para obtener imágenes dentro de células vivas, utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM por sus siglas en inglés). La investigación se publica en la revista STAR Protocols.
El microscopio de fuerza atómica se desarrolló en la década de 1980 y utiliza las diferencias entre las fuerzas de una superficie de muestra y una sonda o punta afilada, de forma piramidal o cónica, que va unida a un listón o palanca microscópica muy flexible, permitiendo identificar superficies y generar imágenes de la topografía con resolución a nanoescala. La técnica se ha vuelto cada vez más sofisticada para extraer información sobre muestras a velocidades suficientes para que la herramienta capture imágenes en movimiento a nanoescala. Sin embargo, hasta ahora se ha limitado a superficies.
Existen otras técnicas que pueden proporcionar una visión del interior de una célula, pero tienen limitaciones. Por ejemplo, existe la microscopía electrónica, que es capaz de resolver detalles a nanoescala y más pequeños, pero las condiciones de operación requeridas no son compatibles con las células vivas. Alternativamente, la microscopía de fluorescencia se usa regularmente en células vivas, pero si bien existen técnicas de fluorescencia para aumentar la resolución, existen desafíos prácticos que inhiben las imágenes de fluorescencia a nanoescala.
AFM no tiene ninguna de estas limitaciones, y al añadir a la herramienta una nanoaguja para penetrar en las células, Fukuma, Ichikawa y sus colaboradores han demostrado recientemente su capacidad para obtener imágenes a nanoescala del interior de las células, que describen como nanoendoscopia-AFM.
En su protocolo, los investigadores dividen el método para la nanoendoscopia-AFM en cuatro etapas. Los primeros pasos implican la preparación celular y la tinción con un tinte fluorescente y la verificación de la fluorescencia, que se utiliza para identificar el área de imágenes rápidamente. Lo siguiente es la fabricación de las nanoagujas en sí, para lo cual hay dos opciones: grabar una estructura de nanoagujas con un haz de iones enfocado o construir una con deposición de haz de electrones.
Luego viene la etapa de nanoendoscopia en sí, y en el informe los investigadores describen el enfoque para la nanoendoscopia 2D y 3D. Incluso hay detalles descritos para describir la mejor manera de limpiar después de haber capturado las imágenes de la nanoendoscopia, antes de finalmente delinear el procesamiento de datos necesario para visualizar los datos medidos. El método está repleto de consejos para completar con éxito cada etapa, así como una guía para solucionar problemas cuando las cosas no funcionen como se esperaba.
Esta técnica servir para la observación de estructuras intracelulares intactas, incluyendo mitocondrias, adherencias focales, retículo endoplásmico, lisosomas, aparato de Golgi, conexiones de orgánulos y estructuras separadas de fase líquido-líquido. Concluyen: "Esperamos que este protocolo se convierta en una herramienta estándar para estudiar estructuras a nanoescala".
Más información: Takehiko Ichikawa et al, Protocol for live imaging of intracellular nanoscale structures using atomic force microscopy with nanoneedle probes, STAR Protocols (2023). DOI: 10.1016/j.xpro.2023.102468
Proporcionado por: Kanazawa University
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